PMC

Pseudomonas aeruginosa är en allestädes närvarande miljögramnegativ bakterie som finns i jord och vatten. Det är också en opportunistisk patogen som orsakar infektioner hos individer med medfödda immundefekter, inklusive patienter med cystisk fibros (CF) (8). P. aeruginosa möter miljöer med låg syre i jord och vatten. Bevis tyder på att hos människor med CF kan bakterier åtminstone delvis vara i en syrefattig miljö inom mucopurulenta massor eller biofilmer i luftvägarna (19). P. aeruginosa kan växa anaerobt i närvaro av terminala elektronacceptorer, såsom nitrat (NO3−), nitrit (NO2−) och kväveoxid (N2O), eller när l-arginin är ett substrat för tillväxt (21). CF-luftvägsslem är tillräckligt rik på NO3 – och NO2− för att stödja den anaeroba tillväxten av P. aeruginosa (7, 19). I denna studie utfördes en jämförelse av P. aeruginosa-proteomen under tillväxt i närvaro och frånvaro av syre.

P. aeruginosa stam PAO1 erhållen från Steve Lory (Harvard Medical School, Boston, MA) odlades i 125 ml kolvar i Luria broth (LB) kompletterad med 1% KNO3 med skakning vid 200 rpm vid 37 kcal C för aerob tillväxt. Anaerob tillväxt slutfördes som tidigare beskrivits (9) i 80 ml medium i 100 ml Wheaton serumflaskor (Fisher Scientific) med gummiproppar. Mediet berövades syre genom att utsättas för bubbling med N2-gas under 1 h. För både aeroba och anaeroba förhållanden skördades bakterier vid den sena logaritmiska tillväxtfasen, vid vilken punkt celldensiteten (optisk densitet vid 600 nm) av den anaeroba kulturen var 44% av densiteten hos den aeroba kulturen. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan pHs för de skördade kulturerna (pH 7,6 för den anaeroba kulturen och pH 7,4 för den aeroba kulturen). Lika stora mängder denaturerat och reducerat helcellsprotein (2.0 mg från varje tillväxttillstånd) märktes med antingen lätt (12c) eller tungt (13C) klyvbart isotopkodat affinity tag (ICAT) reagens (Applied Biosystems, Foster City, CA), bearbetat och analyserat som tidigare beskrivet (3). De rapporterade uppgifterna är medelvärdena för minst två oberoende experiment.

sex hundra tio P. aeruginosa-proteiner identifierades och kvantifierades med användning av ICAT (för en fullständig lista över proteiner, se tabell S1 i tilläggsmaterialet). Bland 151 proteiner vars överflöd förändrades under anaerob tillväxt var 76 högre i överflöd (tabell (Tabell1)1) och 75 var lägre i överflöd (tabell (Tabell2).2). Som förväntat uttrycktes 13 proteiner som deltar i anaerob tillväxt och denitrifikation (inklusive produkter av Nir -, nos-och nar-gener) vid högre nivåer under anaerob tillväxt (tabell (Tabell1).1). Dessa resultat tyder på att de observerade förändringarna i proteininnehållet inkluderar de som specifikt härrör från tillväxt vid olika syrenivåer.

förändringarna i det detekterade proteomet kan också återspegla skillnader i all densitetsberoende reglering utöver effekterna av syrespänning, med tanke på den lägre relativa celldensiteten hos den skördade anaeroba kulturen. Faktum är att 29 proteiner som detekteras i lägre överflöd i anaerobt odlade celler kodas av gener som tidigare visat sig vara kvorumavkännande inducerad (5, 16, 17). Dessa inkluderar vätecyanidsyntasunderenheterna HcnB och HcnC; Pseudomonas kinolon signalerar biosyntetiska enzymer PqsB, PqsC och PqsD; och PhnB (tabell (Table2).2). I överensstämmelse med våra resultat befanns hcn-och pqs-gener också transkriberas under anaerob tillväxt genom en ny DNA-mikroarrayanalys med användning av aeroba och anaeroba kulturer skördade vid samma celldensitet (1) (Tabell (Tabell22).

för att identifiera utsöndrad P. aeruginosa-proteiner med förändrade nivåer under anaerob tillväxt koncentrerades supernatantproteiner för odling (11) och separerades med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) (Fig. (Fig.1).1). Fyra Coomassie-färgade proteinband, motsvarande differentiellt uttryckta proteiner, identifierades och analyserades som i en tidigare studie (4) (Fig. (Fig.1).1). Överflödet av tre utsöndrade proteiner tycktes minska under anaerob tillväxt: CbpD-kitinbindande protein, LasB elastas och ett protein med okänd funktion kodad av PA0572. Tidigare proteomiska studier visade att alla tre av dessa proteiner är kvorumavkännande inducerad (11). Ett protein verkade ökas i överflöd under anaerob tillväxt och identifierades som antingen flagellärt filamentprotein FliC eller flagellärt capping protein FliD (på grund av överlappningen i egenskaperna hos dessa två proteiner).

de flesta P. aeruginosa yttre membranproteiner innehåller inte cysteinrester och kan därför inte analyseras med ICAT (4). Därför användes tvådimensionell (2D) sida som en komplementär Metod (4). Flera yttre membranproteiner (Fig. (Fig.2) 2) skars ut från 2D-gelen och identifierades (4). OprE verkade öka i överflöd under anaerob tillväxt, medan OprF och OprH tycktes minska i överflöd (Fig. (Fig.2).2). Alla tre proteinerna migrerade som flera arter under isoelektrisk fokusering (Fig. (Fig.2).2). Minskad överflöd av OprF under anaerob tillväxt bekräftades genom immunoblotting av yttre membranproteiner (data visas inte), med användning av ett polyklonalt anti-OprF-antiserum (en gåva från Robert Hancock, University of British Columbia i Vancouver, Kanada).

bland P. aeruginosa-proteinerna som visade ökat överflöd under anaerob tillväxt (tabell (Tabell1;1; Fig. Fig.1), 1), Flera bidrar till funktioner som är involverade i bildandet och utvecklingen av biofilmer. Dessa proteiner inkluderar katabolit-repressionskontrollproteinet Crc och de ryckande motilitetsproteinerna PilU, PilG och ChpA (12, 13, 18). I överensstämmelse med en ökad nivå av Crc i anaerobt odlade celler (tabell (Tabell1),1) minskade kända mål för Crc-förtryck i överflöd (tabell (Tabell2), 2), inklusive hmga-och bkd-genprodukterna (6, 10). ChpA och PilG är komponenter i ett komplext regleringssystem som styr ryckningsmotilitet (18). Sammantaget tyder dessa resultat på att uttryck eller funktion av cellytans bilagor som påverkar biofilmbildning förändras under anaerob tillväxt. Sådana förändringar kan bidra till den ökade biofilmbildningen som observerats för P. aeruginosa som växer anaerobt (20).

förutom de förändringar i yttre membranproteiner som observerades under anaerob tillväxt visade ICAT-analys att flera enzymer involverade i biosyntesen av P. aeruginosa lipopolysackarid (LPS) uttrycktes vid högre nivåer under anaerob tillväxt (tabell (Tabell1).1). Dessa inkluderade en homolog av beta-hydroxylas LpxO2, som hydroxylaterar lipid A-fettsyror (14); LPS-kärnheptosyltransferaser WaaC och WaaF (2, 15); och WbpG, som kodas av ett genkluster som deltar i syntesen av ett långt B-band O-antigen. Dessa resultat tyder på att LPS-innehållet kan förändras som en följd av anaerobios.

Sammanfattningsvis förändras P. aeruginosa-proteomet signifikant under anaerob tillväxt. Vi identifierade 617 proteiner totalt: 610 genom ICAT-analys, 4 genom SDS-SIDANALYS och 3 genom 2D-sidanalys. Av de 617 identifierade proteinerna varierade överflödet av 158 mellan anaerobt odlade och aerobt odlade celler. Eftersom P. aeruginosa nådde en lägre celltäthet under våra anaeroba tillväxtförhållanden än under aeroba tillväxtförhållanden, kan densitetsberoende förändringar i proteinuttryck ha bidragit till proteomet som vi upptäckte under anaerob tillväxt. Ändå är bakteriell celldensitet sannolikt begränsad i många miljönischer där flera näringsämnen (inklusive syre) är knappa. Därför bidrar förändringarna i proteinnivåer som vi har upptäckt till en förståelse för hur proteom och metaboliskt tillstånd hos bakterier varierar som svar på olika miljöer. Direktanalys av bakterieproteininnehåll är en robust teknik för att observera anpassningen av bakterier till specifika miljönischer, inklusive CF-luftvägen.