proteinkinaser är den största enzymsuperfamiljen som är involverad i cellsignaltransduktion och representerar terapeutiska mål för en rad sjukdomar. Det har varit intensiva ansträngningar från många laboratorier för att förstå deras katalytiska mekanismer, upptäcka hämmare och urskilja deras cellulära funktioner. I denna översyn kommer vi att beskriva två metoder som utvecklats för att analysera proteinkinaser: bisubstrat analog hämning och fosfonat analog utnyttjande. Båda dessa metoder har använts i kombination med protein semisyntesmetoden uttryckt proteinligering för att främja vår förståelse av Kinas-substratinteraktioner och funktionell belysning av fosforylering. Tidigare arbete med arten av proteinkinasmekanismen föreslår att det följer ett dissociativt övergångstillstånd. En bisubstrat analog designades mot insulinreceptorkinas för att efterlikna geometrin hos ett dissociativt övergångstillståndsreaktionskoordinatavstånd. Denna bisubstratförening visade sig vara en potent hämmare mot insulinreceptorkinas och upptog både peptid-och nukleotidbindningsställen. Bisubstratföreningar med förändrad vätebindningspotential samt varierande distanser mellan adenin och peptiden visar vikten av de ursprungliga designfunktionerna. Vi har också visat att relaterade bisubstratanaloger kan användas för att kraftigt blockera serin / treoninkinaser inklusive proteinkinas A. Eftersom många proteinkinaser känner igen vikta proteinsubstrat för effektiv fosforylering var det fördelaktigt att införliva peptid-ATP-konjugaten i proteinstrukturer. Med användning av uttryckt proteinligering producerades ett src-ATP-konjugat och visade sig vara en hög affinitetsligand för Csk-tyrosinkinas. Nonhydrolyzable härmar av phosphoSer / phosphoTyr kan vara användbara i att undersöka funktionaliteten av phosphorylationhändelser. Med hjälp av uttryckt proteinligering har vi använt fosfonometylenfenylalanin och fosfonometylenalanin för att sondera fosforyleringen av Tyr respektive Ser. Dessa verktyg har tillåtit en analys av SH2-fosfataserna (SHP1 och SHP2), vilket avslöjar en ny intramolekylär stimulering av katalytisk aktivitet medierad av motsvarande fosforyleringshändelser. De har också använts för att karakterisera den cellulära regleringen av melatoninrytmen enzym genom fosforylering.