det är avgörande att ha kontroll över virustitern i experimentellt arbete med virus. För att underlätta jämförelser mellan studier utförda vid olika laboratorier är det önskvärt att använda harmoniserade standardmetoder. För humant herpesvirus 6 (HHV-6) , ett herpesvirus som de flesta har utsatts för , används metoden 50% vävnadsodlingsinfektivitetsdos (TCID50) ofta för viral titerbedömning. En vanligt använd avläsning är okulär inspektion för cytopatiska effekter (CPE), dvs utvidgning av de infekterade cellerna . Ett hinder med detta tillvägagångssätt är att celler kan förstora även när de inte smittas. Det är särskilt svårt vid infektionsgränsen i titreringsserien ’ eftersom celler förstorade på grund av infektion tenderar att förstora mindre med ökad utspädning av viruset (ytterligare fil 1: figur S1). Immunofluorescensanalys (IFA) är en alternativ avläsningsmetod för okulär inspektion vid tcid50-bedömning eller för beräkning av infektiösa enheter, dvs fraktionen av infekterade celler . Den IFA-baserade avläsningen är mer distinkt när det gäller att diskriminera infekterade från oinfekterade celler men färgningen är mödosam och ett stort antal celler måste räknas för att få tillförlitliga värden. Övervakningen av enskilda celler innebär en risk att misstolka en Cells positivitet, en nackdel med både okulär inspektion och IFA-baserade avläsningar. Därför utvecklade och validerade vi en alternativ avläsning av tcid50 där ökningen av viral DNA-belastning mäts i varje titreringsbrunn av tcid50-odlingsplattor med användning av kvantitativ PCR i realtid (Q-PCR). Detta tillvägagångssätt jämfördes med okulär inspektion och IFA-avläsningar av TCID50 och med infektionsenheterna som beskrivs ovan.
HHV-6A (GS-stam) förökades i t-cellinjen HSB-2 i GlutaMAX innehållande rpmi 1640-medium (Invitrogen, Storbritannien) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Hyklon, UT), 100 U/ml penicillin och 100 kg/ml streptomycin (Invitrogen). När cirka 50% av de levande cellerna hade förstorats skördades supernatanten och frystes omedelbart i alikvoter vid -80 C-C tills analys. Som kontroller inaktiverades virussupernatant i passage 17 (P17) av UV-ljus i 20 minuter eller med värmebehandling vid 56 cc1 h. HHV-6A-replikation i HSB-2-celler följdes i tio dagar med användning av Q-PCR (Applied Biosystems, Storbritannien) som tidigare beskrivits . Före Q-PCR-analys extraherades DNA från cellsuspensionerna med användning av en 96-brunnsplatta pärlbaserad kit enligt tillverkarens protokoll (MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit, Applied Biosystems). För att bedöma HHV-6A-DNA-innehållet i virala satser utfördes Q-PCR som beskrivits ovan efter DNA-extraktion med användning av filterkolumner (QIAGEN GmbH, Tyskland).
för att ställa in tcid50-odlingsplattorna såddes cellsuspensioner av 40 OC 104 HSB-2-celler per brunn i rundbotten 96-brunnskulturplattor. Cellerna inokulerades i 3-4 timmar med 160 uccl femfaldiga utspädningar av HHV-6A supernatant, sex replikat per utspädning. Mock och medium kontroller inkluderades i tredubbla brunnar på alla plattor. Cellerna tvättades en gång innan 50-70 oc-l cellsuspension samplades från varje brunn och lagrades vid -80 oc-C som nolldag efter infektion (dpi) prover. De återstående cellsuspensionerna inkuberades i sju dagar vid 37 kcal C. Vid sju dpi utsattes den tinade noll dpi-plattan och de sju dpi-plattorna för DNA-extraktion med användning av det pärlbaserade kit som beskrivits ovan. Därefter kvantifierades viralt DNA med Q-PCR såsom beskrivits ovan.
för IFA fixerades cellerna på glasskivor med en 1:1-blandning av aceton och metanol vid -20 C i 10 minuter, blockerades med 5% getserum och 3% BSA i PBS och färgades med en primär musmonoklonal antikropp specifik för HHV-6 glykoprotein gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD). Färgningen visualiserades av en Alexa 633 konjugerad get anti-mus IgG (Invitrogen). Färgning med 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (Vektorlaboratorier, CA) användes för att visualisera cellkärnorna. Täckglasen monterades med monteringsmedia (DAKO A/S, Danmark) och bilderna analyserades med hjälp av ett konfokalt mikroskop (Leica Microsystems, Tyskland). Fraktionen av infekterade celler bestämdes genom manuell räkning. Om 1/3 av cellerna innehöll viralt protein, räknades 25 celler per brunn och om < 1/3 av cellerna innehöll viralt protein räknades 100 celler per brunn. Wells där 2% av cellerna som färgades positivt ansågs infekterade. Nivån av viral DNA-belastningsökning i varje brunn korrelerades med IFA-färgningen som konstruerade en formel i programvaran Excel (Microsoft, WA). Denna formel frågar om viralt DNA i en viss brunn i tcid50-plattan har skiftat ett visst antal gånger som är inställt, och om samma brunn var positiv i IFA eller inte.
för jämförelser med Q-PCR-avläsningen bedömdes alla tcid50-plattor genom okulär inspektion med hjälp av ett faskontrastmikroskop av två oberoende inspektörer (okulär TCID50). Wells ansågs vara infekterade om minst en förstorad cell hittades. För båda avläsningsmetoderna beräknades TCID50 enligt Reed-och Muench-formeln .
tcid50-resultaten bestämda med Q-PCR (Q-PCR TCID50) jämfördes med bedömningen av smittsamma enheter av IFA (personlig kommunikation med Louis Flamand) vid tre tidpunkter för P19 och en för P27. Kortfattat inokulerades 2,5*105 HSB-2-celler som beskrivits ovan med olika utspädningar av virus i tredubbla brunnar för varje utspädning. Vid två dpi utsattes cellerna för IFA som riktade sig mot det tidiga virala proteinet p41 (klon 9A5D12, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) såsom beskrivits ovan. Den virala titern, uttryckt som infektiösa enheter per ml, beräknades genom att multiplicera fraktionen av infekterade celler med det totala antalet celler vid noll dpi och utspädningsfaktorer.
för att bestämma den optimala tidspunkten för mätningar av viral DNA-belastningsökning följdes virusreplikation i tio dagar. Sju dagar krävdes för att nå tillräcklig ökning av viralt DNA (Figur 1) och valdes därför som skördetidpunkt. För att ställa in skärpunkten för relativ viral DNA-ökning motsvarande positiv infektion korrelerades den virala DNA-belastningsökningen med viralt proteinuttryck. IFA utfördes vid sju dpi på celler från varje brunn i tre tcid50-plattor för två olika virussatser. Den optimala skärpunkten befanns vara en tio gånger ökning av viralt DNA, där korrelationen med proteinuttryck sågs i 93% av brunnarna (Figur 2).
replikering av HHV-6A (GS-stam) följt av Q-PCR. De data som visas är genomsnittliga resultat (sem) av tredubbla kulturer för varje infektionsmångfald (moi). Anslutande linjer avbryts när den virala DNA-belastningen sjönk under detektionsgränsen.
bestämning av skärpunkt för infektion. Den optimala skärpunkten för infektion befanns vara en tio gånger ökning där korrelationen med proteinuttryck sågs i 93% av brunnarna av IFA med en antikropp riktad mot det sena virala proteinet gp116/54/64. Inget väl innehöll viralt protein där viral DNA-belastningen inte hade ökat tio gånger. De data som visas är genomsnittliga resultat (sem-sem) från tre tcid50-plattor.
jämförelse av värdena för Q-PCR TCID50 till okulär och IFA TCID50, en Q-PCR TCID50 motsvarade 1, 41 okulär och 1, 03 IFA TCID50 baserat på 13 respektive 5 bedömningar. Q-PCR TCID50 gav inte statistiskt olika värden jämfört med okulär eller IFA TCID50 (p = 0,41 respektive p = 0,29) (parat t-test) (Tabell 1).
virala DNA-kopieringsnummer används ofta som en grov uppskattning av mängden virala partiklar som en viss viral sats innehåller. Det är dock osäkert hur väl detta motsvarar smittsamhet. För att bedöma detta jämfördes tcid50-värden med de virala DNA-kopieringsnumren för respektive sats. De genomsnittliga förhållandena för viral DNA-belastning till Q-PCR tcid50-värden i virussatserna var likartade för P17 och P19; 6, 3*105 respektive 2, 0*106 virala DNA-kopior per TCID50 respektive. För P21 var dock förhållandet betydligt högre, 1,3 * 108 virala DNA-kopior per TCID50 (Tabell 1). Således är mätning av viralt DNA i batchs supernatanter otillräcklig för att korrekt tilldela smittsamheten hos en batch och därför bör biologiska analyser utföras för att exakt bestämma virala titrar.
den genomsnittliga intra-analyskoefficienten för variation (CV) för Q-PCR TCID50 var 9%, bestämd genom parallella dubbla extraktioner och Q-PCR av tre tcid50 odlingsplattor. För okulär TCID50 var intra-assay CV 45%, bestämt av totalt tolv tcid50-odlingsplattor lästa av två oberoende bedömare. Intra-analysen CV var 14% för IFA TCID50 bestämd genom två parallella färgning av celler från två körningar. För de infektiösa enheterna närmar sig intra-analys CV var 43% bestämd av fyra parallella färgning av celler från en körning. Den genomsnittliga inter-assay CV var 73% för Q-PCR TCID50 och 66% för okulär TCID50, bestämd för tre virussatser kör fem, tre respektive tre gånger. För IFA TCID50 var CV-analysen 25%, bestämd för en batchkörning tre gånger. För de smittsamma enheterna närmar sig Inter-analys CV var 77%, bestämd av tre separata körningar för en sats.
Sammanfattningsvis korrelerar Q-PCR TCID50-metoden som beskrivs här väl med uttryck av virala proteiner och har således hög specificitet för infektiös dos. Det är mer robust än okulär TCID50, IFA TCID50 och infektionsenheterna närmar sig, baserat på CV-värdena inom analysen. Intra-assay CV är i denna inställning ett mått på hur exakt en viss avläsningsmetod är och är därför det mest exakta värdet för jämförelser av de olika metoderna. För att anpassa metoden måste skärpunkten bestämmas för varje testad virusstam och varje cellinje som används. Q-PCR-avläsningsmetoden är mer mödosam än okulär inspektion, men enligt vår mening betydligt mindre mödosam än IFA TCID50 och infektionsenheterna närmar sig. Det är dyrare när det gäller laboratorieresurser än okulär inspektion, IFA TCID50 och infektionsenheterna. Men våra data betonar vikten av att utföra biologiska analyser för att exakt bestämma virala titrar, vilket kan motivera kostnaden och arbetet. Vidare kan bättre standardisering av virala titerbedömningsmetoder som används inom HHV-6-fältet öka överensstämmelsen mellan olika studier.